A431-A人表皮癌細(xì)胞

【背景資料】 見細(xì)胞說明書

【產(chǎn)品來源】 細(xì)胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國(guó)內(nèi)外著名大學(xué)建系

"公司提供貼壁、半貼壁、懸浮、半懸浮、貼壁與懸浮混合等細(xì)胞特性，一般細(xì)胞培養(yǎng)PBS量是10%，如果出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不良情況，可以提高PBS量到15%，SHEE人永生化食管上皮細(xì)胞待細(xì)胞穩(wěn)定后，調(diào)回PBS量10%，對(duì)于初次實(shí)驗(yàn)者，一般細(xì)胞培養(yǎng)，都需要加入雙抗防止細(xì)胞污染，細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，我們開始寄送，這樣可以保持細(xì)胞收到時(shí)，良好的細(xì)胞活力。

一、售前
         杭州仟諾生物專業(yè)為國(guó)內(nèi)科研提供高品質(zhì)細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)服務(wù)，QC檢測(cè)合格后發(fā)貨保證細(xì)胞狀態(tài)良好，發(fā)貨前保證質(zhì)量。
 
二、售后
         收到細(xì)胞7天內(nèi)出現(xiàn)狀態(tài)不佳等情況請(qǐng)及時(shí)反饋，會(huì)有技術(shù)同步指導(dǎo)操作協(xié)助解決，如仍未養(yǎng)活免費(fèi)重發(fā)。建議及時(shí)保種，有備無(wú)患！
 
三、細(xì)胞生長(zhǎng)條件：

 
四、細(xì)胞收到后處理
    細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿*培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運(yùn)輸?shù)?/span>zui好辦法。收到細(xì)胞回到自己的實(shí)驗(yàn)室后，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作。鏡下觀察：未超過80%匯合度時(shí)，可將瓶裝的*培養(yǎng)液移入廢液缸中，原瓶（T25瓶）保留6-8ml*培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞需離心處理，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時(shí)，根據(jù)情況傳代或者凍存，具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
 
五、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中，加入約6ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
 
1、貼壁細(xì)胞，傳代參考如下：
①. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
②. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
③. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
 
④. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

2、懸浮細(xì)胞，傳代參考如下：

方法①：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法②：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
 
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心5分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
 

A431-A人表皮癌細(xì)胞

   剛收到細(xì)胞時(shí)，胎牛血清可以用15%培養(yǎng)兩三天，利于細(xì)胞盡快恢復(fù)狀態(tài)，細(xì)胞穩(wěn)定后
再調(diào)回10%即可
   收到細(xì)胞后如細(xì)胞狀態(tài)不佳，或培養(yǎng)中遇到問題，煩請(qǐng)當(dāng)天盡快聯(lián)系，以便處理。當(dāng)天及時(shí)反饋細(xì)胞情況和細(xì)胞照片是售后跟蹤處理重要參考依據(jù)，請(qǐng)您務(wù)必重視。

1. 為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代？
    答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)得以繼續(xù)。
2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？
    答：通常細(xì)胞生長(zhǎng)得非?？鞎r(shí)，pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。
       (1)按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％。
       (2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。
       (3)松開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。
       (4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。
       (5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
3.培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響？
    答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。
4.購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
    答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，用離心去除DMSO比較好。
5.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
    答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；細(xì)胞置于–80 ℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。
6.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
    答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
7.冷凍保存細(xì)胞之方法？
    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃(30－60 分鐘)→-20℃( 30 分鐘) → -80℃(16－18 小時(shí)或隔夜)→ 液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。注意：-20℃不可超過1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
 
8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
9.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
    答：欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300×g (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉(zhuǎn)速過長(zhǎng)時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對(duì)離心決定。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中 r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部?jī)?nèi)壁的距離；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF(relative eentrifugal force)為相對(duì)離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示表示單位。
10.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？
    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
11.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
    答：除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞)，在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問題。
12.冷凍管應(yīng)如何解凍？
    答：取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺(tái)操作細(xì)胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂

13.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

    答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺(tái)盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，因活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，不被染色。
14.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
    答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。
15.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
    答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
16.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
    答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。
　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。